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Keap1-Nrf2信号通路相关表观遗传调控的研究进展
发表于：2019-02-14 作者：admin 来源：本站 点击量：2724
摘要：Kelch样ECH联合蛋白1-核转录因子E2相关因子2 (Keap1-Nrf2)信号通路是细胞抵御氧化损伤和电子损伤的重要调控途径，激活Nrf2的表达被认为可以预防慢性病。机体内除了基因突变对Keap1-Nrf2信号通路有调控作用以外，表观遗传被认为是另一种重要的调控机制。本文综述了表观遗传(包括DNA甲基化、组蛋白修饰和微RNA)对Keap1-Nrf2信号通路的调控作用，为Keap1-Nrf2信号通路相关的表观遗传调控的深入研究提供参考。
关键词：核转录因子E2相关因子2;Kelch样ECH联合蛋白1;表观遗传；DNA甲基化；组蛋白修饰；微RNA
Research progress in epigenetic regulation of Keap1-Nrf2 signal pathway
Abstract: The kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1)-nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) signaling axis is a key regulator that plays an essential role in cellular defense against oxidative and electrophilic insults. Activation of Nrf2 is considered to be important in preventing chronic diseases and cancer. In addition to gene mutation, epigenetic modification is considered to be another important regulatory mechanism. This article reviews the current status of the epigenetic regulation at Keap1-Nrf2 signaling by DNA methylation, histone modification and microRNAs, providing a reference for further studies.
Key words: nuclear factor erythroid 2-related factor 2; kelch-like ECH-associated protein 1; epigenetic; DNA methylation; histone modification; microRNA
Kelch样ECH联合蛋白1-核转录因子E2相关因 子2(Keap1-Nrf2)信号通路是调控细胞氧化应激水平的关键通路，该通路可调控多种靶基因的表达，包括Ⅱ相代谢酶基因和多种抗炎抗氧化基因，直接影响机体的氧化应激水平[1]。而氧化应激是多种慢性病（包括心血管疾病、代谢性疾病、神经病变性疾病和癌症等其他疾病）发生发展过程的关键原因，调控Keap1-Nrf2信号通路从而调节其下游基因的表达，可能成为预防和治疗相关疾病的重要方法[2]。随着2003年10月人类表观基因组计划的正式实施，表观遗传学研究已经成为生命科学研究领域的热点。越来越多的研究发现，Keap1-Nrf2信号通路异常与DNA甲基化、组蛋白修饰和微RNA等表观遗传改变相关。因此，考察表观遗传对Keap1-Nrf2信号通路的调控已成为探究此通路作用机制的热点之一，也为阐释多种慢性病的发病机制及提供防治策略带来新的思路。
1 Keap1-Nrf2信号通路
核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是 CNC(cap‘n’collar)转录因子家族中的重要成员，具有碱性亮氨酸拉链结构，它是机体氧化应激通路中重要的调节因子之一，可以与抗氧化反应兀件（antioxidant response element，ARE)结合，激活抗氧化基因的表达，发挥抗炎和抗氧化等作用[3]。Kelch样ECH联合蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1)是 Kelch家族多区域阻遏蛋白，是Nrf2最主要的调节蛋白之一，它可以对Nrf2进行负调节。在正常生理状态下，Keap1-Cul3-E3泛素连接酶复合体通过与Nrf2结合使得Nrf2被泛素化，并在胞浆中被蛋白酶体降解；而当机体内活性氧聚积时，Nrf2经过特定的硫醇修饰后与Keap1解离，转移到核内与ARE结合，进一步激活下游一系列抗氧化的新陈代谢基因、排毒基因和其他目标基因，保护机体免受过氧化物、致癌物等毒性物质的侵害[4]。
近年来，关于Keap1-Nrf2信号通路调控的研究引起了广泛关注。在不同疾病中Keap1-Nrf2信号通路的表达均有异常，但是只有部分情况存在Keapl和Nrf2基因突变，因此研究人员推测存在其他方式对Keap1-Nrf2信号通路进行调控，目前研究认为，这种调控机制正是基于表观遗传的调控[5]。
2 表观遗传
表观遗传是指DNA序列没有发生变化，而遗传信息以外的其他可遗传物质发生了改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。表观遗传的调控机制主要分为DNA甲基化、组蛋白修饰和微RNA(microRNA，miRNA)调控[6]。
DNA甲基化是脊椎动物DNA唯一的自然化学修饰方式，也是哺乳动物DNA最常见的复制后调节方式之一，是机体正常发育、分化必需的调节。DNA甲基化是通过DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferases,DNMT)的催化完成的，目前已知哺乳动物细胞中的DNMT有3种：DNMT1、DNMT3a、DNMT3b。DNMT1主要催化子链DNA半甲基化位点甲基化，维持复制过程中甲基化位点的遗传稳定性；DNMT3a和DNMT3b在胚胎发育过程中起着重要的作用，他们以非甲基化的DNA为模板，催化新的甲基化位点形成[7]。在成年脊椎动物体细胞中，DNA甲基化主要发生在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)位点上，CpG位点在基因组中呈不均匀分布。当某些区域CpG序列的密度比平均密度高10-20倍，G+C含量大于50%且长度大于200个碱基时，该类区域即被命名为CpG岛，约有50°%的人类基因含有CpG岛，其通常位于基因上游调控区的启动子中，启动子的甲基化程度影响着基因的正常表达[8-9]。
组蛋白修饰是指组蛋白N末端特殊位点发生的转译后修饰，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等一系列修饰。染色质根据结构和功能的不同可以分为常染色质和异染色质。常染色质处于松散状态，染色质密度较低，较容易转录；异染色质呈高度螺旋化状态，紧密卷缩，抑制转录因子及RNA聚合酶n与染色质结合，从而抑制基因的转录。组蛋白修饰可以改变染色质的结构状态，影响基因的转录活性，进而影响细胞的多种功能[10]。不同的蛋白酶参与组蛋白修饰过程，如组蛋白乙酰转移酶家族（histone acetyltransferases，HATs)和组蛋白脱乙酰基酶家族 (histone deacetylases, HDACs)分别在组蛋白上添加和去除乙酰基，参与组蛋白乙酰化修饰；组蛋白甲基转移酶家族（histone methyltransferases, HMTs)和组 蛋白去甲基转移酶家族（histone dimethyl transferases, HDMs)则可以在组蛋白上添加和去除甲基，参与组蛋白甲基化修饰，这些蛋白酶动态调控组蛋白结构和基因转录的活性[11-12]。
miRNA是广泛存在于真核生物的一种具有调控功能的非编码内源性单链小分子RNA，约由20-25个核苷酸组成，人类约有30%的基因受到miRNA的调节，它通过碱基互补配对来识别靶mRNA，降解mRNA或阻遏靶mRNA翻译，进而影响机体的调节，参与生命的进程[13]。
机体内表观遗传改变往往是DNA甲基化、组蛋白修饰以及非编码RNA三者经过复杂的调控而共同影响的结果。
3 DNA甲基化对Keap1-Nrf2信号通路的调控
3.1DNA甲基化对Nrf2的调控
DNA甲基化对Nrf2的调控是表观遗传对Keap-Nrf2信号通路的调控中较为常见的一种调控。在镍诱导的小鼠肝损伤炎症模型中，小鼠肝部Nrf2启动子的甲基化程度较高，从而导致了Nrf2蛋白与其下游基因血红素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO-1)蛋白表达的下调[14]。在癌症研究中，多种癌症模型中也均发现了Nrf2启动子甲基化程度较正常组高，同时Nrf2及其下游基因的表达受到抑制。研究显示，对促癌剂敏感型JB6小鼠表皮JB6p+细胞内Nrf2启动子区前15个CpG位点高度甲基化，甲基化程度最高达89.3%[15-18]。在小鼠前列腺癌TRAMP-C1细胞中，Nrf2及其下游基因丑0-八醌氧化还原酶1[NAD(P) H: quinone oxidoreductase l，NQO1]和 UDP葡糖醛酸基转移酶1家族多肽A1(UGT1A1)的mRNA与蛋白表达较正常上皮细胞低；前列腺腺癌小鼠组织中Nrf2和NQO1的mRNA与蛋白表达同样较低，这种表达抑制是由Nrf2启动子区CpG岛高度甲基化导致的[19-23]。在人类前列腺癌组织中，同样观察到Nrf2启动子区的CpG岛甲基化程度高，Nrf2基因表达受到抑制，而且该区域前5个CpG位点的甲基化程度较其他CpG位点高[24]。
部分天然药物被证实可使Nrf2启动子区域甲基化程度降低，发挥其抗氧化活性。槲皮素可以降低镍诱导的肝损伤小鼠肝组织Nrf2启动子甲基化程度，促进下游基因HO-1蛋白的表达[14]。芹黄素、丹参酮ⅡA、利血平和三萜乌索酸可以降低JB6p+细胞内Nrf2启动子的甲基化程度；促进下游基因HO-1，HQO1及UGTIA 1 imRNA与蛋白的表达；降低(DNMT1，DNMT3a，DNMT3b)mRNA与蛋白的表达[15-18]。而姜黄素和姜黄素类似物FN1、γ-tocopherol-rich mixture of tocopherols(γ--TmT)、3'-diindolylmethane (DIM)、萝 卜硫素则能够降低TRAMPC1细胞或小鼠前列腺癌组织内启动子的甲基化程度，促进Keap1-Nrf2信号通路下游基因的表达，降低DNMTs蛋白表达[19-23]。然而，使用药物降低Nrf2启动子区域的甲基化却不一定能持续杀伤癌细胞，达到治疗效果。临床数据显示，使用抗癌药物氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU)治疗癌症后期容易产生耐药性，在5-FU杀伤直肠癌细胞的过程中，5-FU降低了癌细胞启动子区域的甲基化程度，激活Nrf2及其相关通路的基因表达，起到了保护癌细胞的作用，使癌细胞对5-FU产生耐药性，增加了治疗难度[25]。
上述研究中可以看到，Nrf2高甲基化造成其表达抑制是肿瘤发生的因素之一，部分药物可降低癌细胞或组织中Nrf2启动子的甲基化程度，但针对Nrf2启动子高甲基化这一特征设计药物来治疗癌症，有产生耐药性或促进肿瘤生长的风险。
3.2 DNA甲基化对Keap1的调控
除了调控Nrf2,DNA甲基化也能通过调控Keap1达到调控Keap1-Nrf2通路的目的。在氧化应激相关疾病的研究中，研究者观察到机体氧化失衡与Keap1-Nrf2通路中启动子区域的去甲基化相关。研究表明，患有年龄相关性白内障患者晶状体内有较强的氧化应激，而同时患有糖尿病的患者，由于高血糖产生了更多的自由基，使得机体内氧化应激增强，晶状体受到的氧化损伤更为严重，而这种氧化损伤是由于患者的晶状体中启动子被去甲基化，Keap1蛋白表达增加，胞内Nrf2蛋白降解量增大，从而抑制Keap-Nrf2信号通路[26]。在糖尿病性心肌患者的心脏组织中，启动子被去甲基化，Nrf2在胞质内降解增多，扰乱了机体Nrf2介导的抗氧化系统[27]。然而，在肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌和直肠癌等癌症发生机制的研究中却发现，Keap1启动子区域具有高甲基化特征，Keap1蛋白表达下调使组织或细胞中Nrf2降解量减少。Wang等[28]的研究表明，人类正常支气管上皮BEAS-2B细胞的Keap1mRNA表达正常；而肺癌相关的细胞（SPC-A1细胞，A549细胞和NCI-H460细胞）和肺癌组织的Keap1启动子区域的CpG位点被甲基化，因此其mRNA表达下降；而经过甲基化抑制剂地西他滨（5-aza)的干预，Keap1mRNA表达上升。在前列腺癌研究中，因启动子区域甲基化而失去Keap1功能的患者在治疗过程中出现化疗抵抗性和放疗抵抗性[29]。在乳腺癌研究中，启动子高甲基化的三阴性患者死亡率较没有甲基化的患者高[30]。在人非小细胞肺癌研究中，从47例癌症患者中发现，47%患者的启动子区域呈高甲基化[31]。同样，在甲状腺癌和宫颈癌研究中启动子高甲基化的患者往往预后不良[32]。在直肠癌CRC细胞和直肠癌患者的组织样品中也发现启动子区高甲基化现象，但并没有显示此变化与预后不良相关[33]。
上述研究中可以看到，在氧化应激疾病中，机体发生氧化失衡时Keap1启动子区域会发生去甲基化，针对这一靶点设计药物抑制Keap1的表达可能成为该类疾病潜在的治疗方法。在癌症中，启动子区域呈高甲基化状态，并与癌症疗效降低和预后不良相关，而Keap1的负调控靶点 Nrf2启动子区域同样呈高甲基化状态，通过改变Keap1-Nrf2通路甲基化状态来进行相关疾病治疗的作用效果很难预测。
4 组蛋白修饰对Keap1-Nrf2信号通路的调控
4.1组蛋白乙酰化对Keap1-Nrf2信号通路的调控
组蛋白修饰对Keap1-Nrf2信号通路调控的研究中，组蛋白乙酰化是研究较多的一种组蛋白修饰。研究发现，非小细胞肺癌患者如果机体内hMOF(—种组蛋白乙酰化转移酶）过表达，会使Nrf2基因发生乙酰化，激活Nrf2的表达，最终加重病情或导致预后不良[34]。Liu等[35]的研究表明，HDAC3可以通过NF-kB对Nrf2通路进行负调控，NF-kB的亚基p65可以通过选择性地从Nrf2的转录激活域上移除CREB结合蛋白（CBP)、促进ARE元件上的内源性HDAC3的增加和促进ARE元件与HDAC3的结合使染色体保持低乙酰化的状态，从而抑制Nrf2-ARE通路，降低ARE元件相关基因的表达。同样，在神经炎症中，HDACs对Nrf2介导的抗氧化反应也具有调控作用。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS)处理过的小神经胶质MCMi。细胞中HDACs的活性增强，组蛋白的乙酰化降低，从而降低Nrf2蛋白及其靶基因尸谷氨酰半胱氨酸合成酶调节亚基的表达；而用丙戊酸和曲古柳菌素（trichostatinA,TSA)等HDAC抑制剂处理细胞，可以显著降低组蛋白H3和H4亚基的乙酰化，增加Nrf2蛋白的表达，修复Nrf2介导的抗氧化作用[36]。TSA刺激人软骨肉瘤SW1315细胞后也可以激活胞内Keap1-Nrf2信号通路；在骨关节炎小鼠模型中，野生型骨关节炎小鼠与Nrf2基因敲除的骨关节炎小鼠同时接受TSA的治疗，野生型小鼠的治疗效果较Nrf2基因敲除小鼠的好，表明在使用HDAC抑制剂治疗骨关节炎的过程中，Nrf2发挥了重要作用[37]。芹黄素、丹参酮HA、利血平、三萜乌索酸、姜黄素、姜黄素类似物FN1、7-TmT、DIM和萝卜硫素也被报道具有HDAC抑制剂的功能，可抑制HDACs的mRNA与蛋白表达来正向调控Keap1-Nrf2信号通路[15-23]。
然而，另有研究显示，在Nrf2应激上升以增强机体抗氧化功能期间，抑制HDAC2会导致Nrf2表达下降，降低Keap1-Nrf2信号通路介导的抗氧化作用。Mercado等[38]发现在BEAS-2B细胞与慢性阻塞性肺疾病（chronicobstructive pulmonary disease，COPD )患者的单核巨噬细胞中，HDAC2有助于维持胞内Nrf2蛋白的稳定性与活性；此研究推测COPD患者体内氧化应激降低了HDAC2的活性，从而降低Nrf2的活性和稳定性，抗氧化作用受限，氧化应激增强，结果进一步损伤了HDAC2的活性。
组蛋白乙酰化与Keap1-Nrf2信号通路的调控是双向调控，Nrf2介导的氧化应激反应可通过调控HDAC的活性在表观遗传层面影响机体的功能稳定。有研究发现，敲除Nrf2基因的小鼠肺中HDAC2蛋白水平有所下降，对慢性烟雾刺激和LPS诱导的肺炎的敏感性会增强，而且引发肺炎后对类固醇的敏感性明显下降[39]。Lam等[40]发现Nrf2基因敲除的小鼠烟熏后肺中的HDAC6蛋白表达较高，HDAC6是自噬介导的气道炎症反应中重要的调控因子。
4.2 组蛋白甲基化对Keap1-Nrf2信号通路的调控
组蛋白甲基化对Keap1-Nrf2通路基因的染色质形态和表达也有重要的调控作用，其主要发生在组蛋白H3和H4的赖氨酸和精氨酸残基上。在耐药性的直肠癌细胞（SNUC5/5-FUR细胞）模型中，癌细胞产生耐药性的原因之一是5-FUR可以诱导细胞中HMTs上调，HMTs通过增加基因组蛋白甲基化导致Nrf2表达增加[41]。Li等[42]在人非小细胞肺癌组织和A549细胞中发现，体内组蛋白甲基化转移酶（enhancer of zeste homolog 2，EZH2)能抑制肺癌细胞的生长，研究表明这是由于EZH2能与启动子结合，使得组蛋白H3第27位赖氨酸上三甲基化（H3K27me3)水平升高，Nrf2、NQO1和HO-1mRNA表达减少。
经过高糖刺激的视网膜内皮细胞中，组蛋白甲基转移酶SetD7被激活，Keap1启动子一甲基化H3K4的水平升高，促进转录因子Sp1与Keap1启动子结合，Keap1表达的增加导致Nrf2在谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基（Gcfc)启动子上的结合减少，使得Gclc和HO-1的表达也下降[43]。在糖尿病视网膜病变模型中，元件一甲基化H3K4和三甲基化H3K4水平的降低及二甲基化H3K4水平的增加使得Nrf2与元件的结合减少并减少谷胱甘肽(glutathione，GSH)的合成[44]。
上述研究中可以发现，在炎症模型中，可以观察到Keap1基因组蛋白甲基化降低或Nrf2基因组蛋白甲基化增加，Nrf2表达下降，导致Nrf2介导的抗氧化能力降低。而在癌症模型中，细胞对5-FU耐药性的产生除了由于其能够降低Nrf2启动子区域的甲基化以外，还由于它可增加Nrf2基因的组蛋白甲基化程度。
5 miRNA对Keap1-Nrf2信号通路的调控
miRNA可直接以Nrf2mRNA为靶标调控Keap1-Nrf2信号通路，而这种调控往往是负调控。Sangokoya等[45]发现患有纯合子镰状细胞贫血患者体内miR-144的增加会降低Nrf2及GSH合成量，最终降低机体对氧化应激的耐受性；而在红白血病K562细胞中发现miR-144直接以Nrf2为靶标促使其降解。Narasimhan等[46]用生物信息学技术在计算机上预测出4种以Nrf2为靶标的miRNAs:hsa-miR27a，hsa-miR153，hsa-miR142-5p和hsa-miR144，通过实验发现上述miRNAs的异位表达可以降低神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞内Nrf2mRNA的表达水平和Nrf2蛋白的核质浓度，同时降低了NQO1、Gclc和谷胱甘肽还原酶mRNA与蛋白的表达。在乳腺癌MCF-7细胞中，miR-28的异位表达可以影响细胞的锚定非依赖性生长，此结果表明miR-28可促使Nrf2降解并通过Nrf2通路来抑制乳腺癌的转移和生长[47]。而在大鼠乳腺癌组织和人乳腺癌MCF-7细胞和T47D细胞中，研究表明miR-93表达水平的上升与Nrf2mRNA和蛋白表达的下降有关[48]。
miRNA也可以通过与Keap1相互作用来影响Nrf2信号通路。在人类乳腺癌MDA-MB-231细胞中，Keap1-Nrf2信号通路的失常与miR-200a的表达减少相关，miR-200a可以与Keap1相互作用使其mRNA降解，降低Keap1mRNA和蛋白的水平从而增强Nrf2的核内积累和NQO1mRNA的表达[49]。
此外，miRNA也可以通过与细胞内Nrf2调控子的相互作用来影响Nrf2信号通路。有研究表明，在低氧条件下miR-101以Cul3为靶标，通过降解Cul3使得Nrf2蛋白更稳定并诱导HO-1蛋白表达[50]。Hou等[51]的研究表明，let-7miRNAs(let-7b，7c)可抑制BRCA1相关解旋酶1(BRCA1-associatedC-terminalhelicase1，BACH1)的水平来增强HO-1mRNA与蛋白的表达。在内皮细胞中，前炎症因子miR-155同样以BACH1为靶标，通过降解BACH1来诱导HO-1表达的上升[52]。另一方面，Nrf2通过HDAC4来下调miR-1与miR-206的表达，说明Nrf2可反过来调控miRNA的转录[53]。
从上述研究中可以发现，miRNA能够与Nrf2、Keap1和Nrf2调控子相互作用来调控Keap1-Nrf2信号通路，Nrf2亦可调节miRNA的转录。
6 展望
Keap1-Nrf2信号通路与机体内多种生理功能及病理改变密切相关，对机体抗氧化、抗炎、预防慢性病发生和控制肿瘤发生发展有重要调控作用。该信号通路受到多因子、多层面的调控，而表观遗传对Keap1-Nrf2信号通路有着显著的调控作用。因此，研究Keap1-Nrf2信号通路的表观遗传变化，有助于进一步认识在病理情况下此通路异常的原因，也为癌症、糖尿病、神经退行性疾病、慢性炎症等相关疾病的治疗提供新的思路。
原文：萧紫庭, 苏薇薇, 李沛波. Keap1-Nrf2信号通路相关表观遗传调控的研究进展[J]. 中南药学, 2018(1):76-81.
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关键词：核转录因子E2相关因子2;Kelch样ECH联合蛋白1;表观遗传；DNA甲基化；组蛋白修饰；微RNA
Research progress in epigenetic regulation of Keap1-Nrf2 signal pathway
Abstract: The kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1)-nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) signaling axis is a key regulator that plays an essential role in cellular defense against oxidative and electrophilic insults. Activation of Nrf2 is considered to be important in preventing chronic diseases and cancer. In addition to gene mutation, epigenetic modification is considered to be another important regulatory mechanism. This article reviews the current status of the epigenetic regulation at Keap1-Nrf2 signaling by DNA methylation, histone modification and microRNAs, providing a reference for further studies.
Key words: nuclear factor erythroid 2-related factor 2; kelch-like ECH-associated protein 1; epigenetic; DNA methylation; histone modification; microRNA
Kelch样ECH联合蛋白1-核转录因子E2相关因 子2(Keap1-Nrf2)信号通路是调控细胞氧化应激水平的关键通路，该通路可调控多种靶基因的表达，包括Ⅱ相代谢酶基因和多种抗炎抗氧化基因，直接影响机体的氧化应激水平[1]。而氧化应激是多种慢性病（包括心血管疾病、代谢性疾病、神经病变性疾病和癌症等其他疾病）发生发展过程的关键原因，调控Keap1-Nrf2信号通路从而调节其下游基因的表达，可能成为预防和治疗相关疾病的重要方法[2]。随着2003年10月人类表观基因组计划的正式实施，表观遗传学研究已经成为生命科学研究领域的热点。越来越多的研究发现，Keap1-Nrf2信号通路异常与DNA甲基化、组蛋白修饰和微RNA等表观遗传改变相关。因此，考察表观遗传对Keap1-Nrf2信号通路的调控已成为探究此通路作用机制的热点之一，也为阐释多种慢性病的发病机制及提供防治策略带来新的思路。
1 Keap1-Nrf2信号通路
核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是 CNC(cap‘n’collar)转录因子家族中的重要成员，具有碱性亮氨酸拉链结构，它是机体氧化应激通路中重要的调节因子之一，可以与抗氧化反应兀件（antioxidant response element，ARE)结合，激活抗氧化基因的表达，发挥抗炎和抗氧化等作用[3]。Kelch样ECH联合蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1)是 Kelch家族多区域阻遏蛋白，是Nrf2最主要的调节蛋白之一，它可以对Nrf2进行负调节。在正常生理状态下，Keap1-Cul3-E3泛素连接酶复合体通过与Nrf2结合使得Nrf2被泛素化，并在胞浆中被蛋白酶体降解；而当机体内活性氧聚积时，Nrf2经过特定的硫醇修饰后与Keap1解离，转移到核内与ARE结合，进一步激活下游一系列抗氧化的新陈代谢基因、排毒基因和其他目标基因，保护机体免受过氧化物、致癌物等毒性物质的侵害[4]。
近年来，关于Keap1-Nrf2信号通路调控的研究引起了广泛关注。在不同疾病中Keap1-Nrf2信号通路的表达均有异常，但是只有部分情况存在Keapl和Nrf2基因突变，因此研究人员推测存在其他方式对Keap1-Nrf2信号通路进行调控，目前研究认为，这种调控机制正是基于表观遗传的调控[5]。
2 表观遗传
表观遗传是指DNA序列没有发生变化，而遗传信息以外的其他可遗传物质发生了改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。表观遗传的调控机制主要分为DNA甲基化、组蛋白修饰和微RNA(microRNA，miRNA)调控[6]。
DNA甲基化是脊椎动物DNA唯一的自然化学修饰方式，也是哺乳动物DNA最常见的复制后调节方式之一，是机体正常发育、分化必需的调节。DNA甲基化是通过DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferases,DNMT)的催化完成的，目前已知哺乳动物细胞中的DNMT有3种：DNMT1、DNMT3a、DNMT3b。DNMT1主要催化子链DNA半甲基化位点甲基化，维持复制过程中甲基化位点的遗传稳定性；DNMT3a和DNMT3b在胚胎发育过程中起着重要的作用，他们以非甲基化的DNA为模板，催化新的甲基化位点形成[7]。在成年脊椎动物体细胞中，DNA甲基化主要发生在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)位点上，CpG位点在基因组中呈不均匀分布。当某些区域CpG序列的密度比平均密度高10-20倍，G+C含量大于50%且长度大于200个碱基时，该类区域即被命名为CpG岛，约有50°%的人类基因含有CpG岛，其通常位于基因上游调控区的启动子中，启动子的甲基化程度影响着基因的正常表达[8-9]。
组蛋白修饰是指组蛋白N末端特殊位点发生的转译后修饰，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等一系列修饰。染色质根据结构和功能的不同可以分为常染色质和异染色质。常染色质处于松散状态，染色质密度较低，较容易转录；异染色质呈高度螺旋化状态，紧密卷缩，抑制转录因子及RNA聚合酶n与染色质结合，从而抑制基因的转录。组蛋白修饰可以改变染色质的结构状态，影响基因的转录活性，进而影响细胞的多种功能[10]。不同的蛋白酶参与组蛋白修饰过程，如组蛋白乙酰转移酶家族（histone acetyltransferases，HATs)和组蛋白脱乙酰基酶家族 (histone deacetylases, HDACs)分别在组蛋白上添加和去除乙酰基，参与组蛋白乙酰化修饰；组蛋白甲基转移酶家族（histone methyltransferases, HMTs)和组 蛋白去甲基转移酶家族（histone dimethyl transferases, HDMs)则可以在组蛋白上添加和去除甲基，参与组蛋白甲基化修饰，这些蛋白酶动态调控组蛋白结构和基因转录的活性[11-12]。
miRNA是广泛存在于真核生物的一种具有调控功能的非编码内源性单链小分子RNA，约由20-25个核苷酸组成，人类约有30%的基因受到miRNA的调节，它通过碱基互补配对来识别靶mRNA，降解mRNA或阻遏靶mRNA翻译，进而影响机体的调节，参与生命的进程[13]。
机体内表观遗传改变往往是DNA甲基化、组蛋白修饰以及非编码RNA三者经过复杂的调控而共同影响的结果。
3 DNA甲基化对Keap1-Nrf2信号通路的调控
3.1DNA甲基化对Nrf2的调控
DNA甲基化对Nrf2的调控是表观遗传对Keap-Nrf2信号通路的调控中较为常见的一种调控。在镍诱导的小鼠肝损伤炎症模型中，小鼠肝部Nrf2启动子的甲基化程度较高，从而导致了Nrf2蛋白与其下游基因血红素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO-1)蛋白表达的下调[14]。在癌症研究中，多种癌症模型中也均发现了Nrf2启动子甲基化程度较正常组高，同时Nrf2及其下游基因的表达受到抑制。研究显示，对促癌剂敏感型JB6小鼠表皮JB6p+细胞内Nrf2启动子区前15个CpG位点高度甲基化，甲基化程度最高达89.3%[15-18]。在小鼠前列腺癌TRAMP-C1细胞中，Nrf2及其下游基因丑0-八醌氧化还原酶1[NAD(P) H: quinone oxidoreductase l，NQO1]和 UDP葡糖醛酸基转移酶1家族多肽A1(UGT1A1)的mRNA与蛋白表达较正常上皮细胞低；前列腺腺癌小鼠组织中Nrf2和NQO1的mRNA与蛋白表达同样较低，这种表达抑制是由Nrf2启动子区CpG岛高度甲基化导致的[19-23]。在人类前列腺癌组织中，同样观察到Nrf2启动子区的CpG岛甲基化程度高，Nrf2基因表达受到抑制，而且该区域前5个CpG位点的甲基化程度较其他CpG位点高[24]。
部分天然药物被证实可使Nrf2启动子区域甲基化程度降低，发挥其抗氧化活性。槲皮素可以降低镍诱导的肝损伤小鼠肝组织Nrf2启动子甲基化程度，促进下游基因HO-1蛋白的表达[14]。芹黄素、丹参酮ⅡA、利血平和三萜乌索酸可以降低JB6p+细胞内Nrf2启动子的甲基化程度；促进下游基因HO-1，HQO1及UGTIA 1 imRNA与蛋白的表达；降低(DNMT1，DNMT3a，DNMT3b)mRNA与蛋白的表达[15-18]。而姜黄素和姜黄素类似物FN1、γ-tocopherol-rich mixture of tocopherols(γ--TmT)、3'-diindolylmethane (DIM)、萝 卜硫素则能够降低TRAMPC1细胞或小鼠前列腺癌组织内启动子的甲基化程度，促进Keap1-Nrf2信号通路下游基因的表达，降低DNMTs蛋白表达[19-23]。然而，使用药物降低Nrf2启动子区域的甲基化却不一定能持续杀伤癌细胞，达到治疗效果。临床数据显示，使用抗癌药物氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU)治疗癌症后期容易产生耐药性，在5-FU杀伤直肠癌细胞的过程中，5-FU降低了癌细胞启动子区域的甲基化程度，激活Nrf2及其相关通路的基因表达，起到了保护癌细胞的作用，使癌细胞对5-FU产生耐药性，增加了治疗难度[25]。
上述研究中可以看到，Nrf2高甲基化造成其表达抑制是肿瘤发生的因素之一，部分药物可降低癌细胞或组织中Nrf2启动子的甲基化程度，但针对Nrf2启动子高甲基化这一特征设计药物来治疗癌症，有产生耐药性或促进肿瘤生长的风险。
3.2 DNA甲基化对Keap1的调控
除了调控Nrf2,DNA甲基化也能通过调控Keap1达到调控Keap1-Nrf2通路的目的。在氧化应激相关疾病的研究中，研究者观察到机体氧化失衡与Keap1-Nrf2通路中启动子区域的去甲基化相关。研究表明，患有年龄相关性白内障患者晶状体内有较强的氧化应激，而同时患有糖尿病的患者，由于高血糖产生了更多的自由基，使得机体内氧化应激增强，晶状体受到的氧化损伤更为严重，而这种氧化损伤是由于患者的晶状体中启动子被去甲基化，Keap1蛋白表达增加，胞内Nrf2蛋白降解量增大，从而抑制Keap-Nrf2信号通路[26]。在糖尿病性心肌患者的心脏组织中，启动子被去甲基化，Nrf2在胞质内降解增多，扰乱了机体Nrf2介导的抗氧化系统[27]。然而，在肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌和直肠癌等癌症发生机制的研究中却发现，Keap1启动子区域具有高甲基化特征，Keap1蛋白表达下调使组织或细胞中Nrf2降解量减少。Wang等[28]的研究表明，人类正常支气管上皮BEAS-2B细胞的Keap1mRNA表达正常；而肺癌相关的细胞（SPC-A1细胞，A549细胞和NCI-H460细胞）和肺癌组织的Keap1启动子区域的CpG位点被甲基化，因此其mRNA表达下降；而经过甲基化抑制剂地西他滨（5-aza)的干预，Keap1mRNA表达上升。在前列腺癌研究中，因启动子区域甲基化而失去Keap1功能的患者在治疗过程中出现化疗抵抗性和放疗抵抗性[29]。在乳腺癌研究中，启动子高甲基化的三阴性患者死亡率较没有甲基化的患者高[30]。在人非小细胞肺癌研究中，从47例癌症患者中发现，47%患者的启动子区域呈高甲基化[31]。同样，在甲状腺癌和宫颈癌研究中启动子高甲基化的患者往往预后不良[32]。在直肠癌CRC细胞和直肠癌患者的组织样品中也发现启动子区高甲基化现象，但并没有显示此变化与预后不良相关[33]。
上述研究中可以看到，在氧化应激疾病中，机体发生氧化失衡时Keap1启动子区域会发生去甲基化，针对这一靶点设计药物抑制Keap1的表达可能成为该类疾病潜在的治疗方法。在癌症中，启动子区域呈高甲基化状态，并与癌症疗效降低和预后不良相关，而Keap1的负调控靶点 Nrf2启动子区域同样呈高甲基化状态，通过改变Keap1-Nrf2通路甲基化状态来进行相关疾病治疗的作用效果很难预测。
4 组蛋白修饰对Keap1-Nrf2信号通路的调控
4.1组蛋白乙酰化对Keap1-Nrf2信号通路的调控
组蛋白修饰对Keap1-Nrf2信号通路调控的研究中，组蛋白乙酰化是研究较多的一种组蛋白修饰。研究发现，非小细胞肺癌患者如果机体内hMOF(—种组蛋白乙酰化转移酶）过表达，会使Nrf2基因发生乙酰化，激活Nrf2的表达，最终加重病情或导致预后不良[34]。Liu等[35]的研究表明，HDAC3可以通过NF-kB对Nrf2通路进行负调控，NF-kB的亚基p65可以通过选择性地从Nrf2的转录激活域上移除CREB结合蛋白（CBP)、促进ARE元件上的内源性HDAC3的增加和促进ARE元件与HDAC3的结合使染色体保持低乙酰化的状态，从而抑制Nrf2-ARE通路，降低ARE元件相关基因的表达。同样，在神经炎症中，HDACs对Nrf2介导的抗氧化反应也具有调控作用。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS)处理过的小神经胶质MCMi。细胞中HDACs的活性增强，组蛋白的乙酰化降低，从而降低Nrf2蛋白及其靶基因尸谷氨酰半胱氨酸合成酶调节亚基的表达；而用丙戊酸和曲古柳菌素（trichostatinA,TSA)等HDAC抑制剂处理细胞，可以显著降低组蛋白H3和H4亚基的乙酰化，增加Nrf2蛋白的表达，修复Nrf2介导的抗氧化作用[36]。TSA刺激人软骨肉瘤SW1315细胞后也可以激活胞内Keap1-Nrf2信号通路；在骨关节炎小鼠模型中，野生型骨关节炎小鼠与Nrf2基因敲除的骨关节炎小鼠同时接受TSA的治疗，野生型小鼠的治疗效果较Nrf2基因敲除小鼠的好，表明在使用HDAC抑制剂治疗骨关节炎的过程中，Nrf2发挥了重要作用[37]。芹黄素、丹参酮HA、利血平、三萜乌索酸、姜黄素、姜黄素类似物FN1、7-TmT、DIM和萝卜硫素也被报道具有HDAC抑制剂的功能，可抑制HDACs的mRNA与蛋白表达来正向调控Keap1-Nrf2信号通路[15-23]。
然而，另有研究显示，在Nrf2应激上升以增强机体抗氧化功能期间，抑制HDAC2会导致Nrf2表达下降，降低Keap1-Nrf2信号通路介导的抗氧化作用。Mercado等[38]发现在BEAS-2B细胞与慢性阻塞性肺疾病（chronicobstructive pulmonary disease，COPD )患者的单核巨噬细胞中，HDAC2有助于维持胞内Nrf2蛋白的稳定性与活性；此研究推测COPD患者体内氧化应激降低了HDAC2的活性，从而降低Nrf2的活性和稳定性，抗氧化作用受限，氧化应激增强，结果进一步损伤了HDAC2的活性。
组蛋白乙酰化与Keap1-Nrf2信号通路的调控是双向调控，Nrf2介导的氧化应激反应可通过调控HDAC的活性在表观遗传层面影响机体的功能稳定。有研究发现，敲除Nrf2基因的小鼠肺中HDAC2蛋白水平有所下降，对慢性烟雾刺激和LPS诱导的肺炎的敏感性会增强，而且引发肺炎后对类固醇的敏感性明显下降[39]。Lam等[40]发现Nrf2基因敲除的小鼠烟熏后肺中的HDAC6蛋白表达较高，HDAC6是自噬介导的气道炎症反应中重要的调控因子。
4.2 组蛋白甲基化对Keap1-Nrf2信号通路的调控
组蛋白甲基化对Keap1-Nrf2通路基因的染色质形态和表达也有重要的调控作用，其主要发生在组蛋白H3和H4的赖氨酸和精氨酸残基上。在耐药性的直肠癌细胞（SNUC5/5-FUR细胞）模型中，癌细胞产生耐药性的原因之一是5-FUR可以诱导细胞中HMTs上调，HMTs通过增加基因组蛋白甲基化导致Nrf2表达增加[41]。Li等[42]在人非小细胞肺癌组织和A549细胞中发现，体内组蛋白甲基化转移酶（enhancer of zeste homolog 2，EZH2)能抑制肺癌细胞的生长，研究表明这是由于EZH2能与启动子结合，使得组蛋白H3第27位赖氨酸上三甲基化（H3K27me3)水平升高，Nrf2、NQO1和HO-1mRNA表达减少。
经过高糖刺激的视网膜内皮细胞中，组蛋白甲基转移酶SetD7被激活，Keap1启动子一甲基化H3K4的水平升高，促进转录因子Sp1与Keap1启动子结合，Keap1表达的增加导致Nrf2在谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基（Gcfc)启动子上的结合减少，使得Gclc和HO-1的表达也下降[43]。在糖尿病视网膜病变模型中，元件一甲基化H3K4和三甲基化H3K4水平的降低及二甲基化H3K4水平的增加使得Nrf2与元件的结合减少并减少谷胱甘肽(glutathione，GSH)的合成[44]。
上述研究中可以发现，在炎症模型中，可以观察到Keap1基因组蛋白甲基化降低或Nrf2基因组蛋白甲基化增加，Nrf2表达下降，导致Nrf2介导的抗氧化能力降低。而在癌症模型中，细胞对5-FU耐药性的产生除了由于其能够降低Nrf2启动子区域的甲基化以外，还由于它可增加Nrf2基因的组蛋白甲基化程度。
5 miRNA对Keap1-Nrf2信号通路的调控
miRNA可直接以Nrf2mRNA为靶标调控Keap1-Nrf2信号通路，而这种调控往往是负调控。Sangokoya等[45]发现患有纯合子镰状细胞贫血患者体内miR-144的增加会降低Nrf2及GSH合成量，最终降低机体对氧化应激的耐受性；而在红白血病K562细胞中发现miR-144直接以Nrf2为靶标促使其降解。Narasimhan等[46]用生物信息学技术在计算机上预测出4种以Nrf2为靶标的miRNAs:hsa-miR27a，hsa-miR153，hsa-miR142-5p和hsa-miR144，通过实验发现上述miRNAs的异位表达可以降低神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞内Nrf2mRNA的表达水平和Nrf2蛋白的核质浓度，同时降低了NQO1、Gclc和谷胱甘肽还原酶mRNA与蛋白的表达。在乳腺癌MCF-7细胞中，miR-28的异位表达可以影响细胞的锚定非依赖性生长，此结果表明miR-28可促使Nrf2降解并通过Nrf2通路来抑制乳腺癌的转移和生长[47]。而在大鼠乳腺癌组织和人乳腺癌MCF-7细胞和T47D细胞中，研究表明miR-93表达水平的上升与Nrf2mRNA和蛋白表达的下降有关[48]。
miRNA也可以通过与Keap1相互作用来影响Nrf2信号通路。在人类乳腺癌MDA-MB-231细胞中，Keap1-Nrf2信号通路的失常与miR-200a的表达减少相关，miR-200a可以与Keap1相互作用使其mRNA降解，降低Keap1mRNA和蛋白的水平从而增强Nrf2的核内积累和NQO1mRNA的表达[49]。
此外，miRNA也可以通过与细胞内Nrf2调控子的相互作用来影响Nrf2信号通路。有研究表明，在低氧条件下miR-101以Cul3为靶标，通过降解Cul3使得Nrf2蛋白更稳定并诱导HO-1蛋白表达[50]。Hou等[51]的研究表明，let-7miRNAs(let-7b，7c)可抑制BRCA1相关解旋酶1(BRCA1-associatedC-terminalhelicase1，BACH1)的水平来增强HO-1mRNA与蛋白的表达。在内皮细胞中，前炎症因子miR-155同样以BACH1为靶标，通过降解BACH1来诱导HO-1表达的上升[52]。另一方面，Nrf2通过HDAC4来下调miR-1与miR-206的表达，说明Nrf2可反过来调控miRNA的转录[53]。
从上述研究中可以发现，miRNA能够与Nrf2、Keap1和Nrf2调控子相互作用来调控Keap1-Nrf2信号通路，Nrf2亦可调节miRNA的转录。
6 展望
Keap1-Nrf2信号通路与机体内多种生理功能及病理改变密切相关，对机体抗氧化、抗炎、预防慢性病发生和控制肿瘤发生发展有重要调控作用。该信号通路受到多因子、多层面的调控，而表观遗传对Keap1-Nrf2信号通路有着显著的调控作用。因此，研究Keap1-Nrf2信号通路的表观遗传变化，有助于进一步认识在病理情况下此通路异常的原因，也为癌症、糖尿病、神经退行性疾病、慢性炎症等相关疾病的治疗提供新的思路。
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