摘要：
癌症正日益成为全世界严重的疾病，目前，每年超过700万人死于癌症，在现有条件下，全球至少三分之一的癌症病例是可以预防的。从日常食用的食物中获取天然产物或许可以很好抑制癌症的发展，构建一个有价值且合理的预防和控制癌症的方法面临着挑战。迄今为止，微量元素硒在临床试验中的使用是有限，但结果表明，硒是最有前途癌症抑制剂。虽然用元素来描述硒的效果是很方便，但必须记住硒的化学形态和剂量是其生物活性的决定因素。ICP-MS检测技术是目前分析硒的形态最现实和最有力的工具。研究表明，对于化学预防活性，可产生甲基硒（如甲基硒代半胱氨酸和甲基硒酸）的硒化合物比其他硒化合物更有效。
关键词：硒，硒蛋白，甲基硒，癌症，HPLC-ICP-MS
 
前言
硒是人体必需微量元素，是抗氧化酶的重要组成部分，这些酶在正常氧自由基代谢中起到保护细胞的作用。人体已有成熟的防卫系统，比如抗氧化剂，来调控损害细胞或导致一些慢性疾病的自由基水平。
 
植物硒含量往往随着区域的变化而差异较大，世界各地，有的土壤中硒含量较低，如澳大利亚，中国东北，朝鲜北部，中国中南部，尼泊尔和西藏。特别是非洲中部和刚果也是极度缺硒地带，当食用当地食物或很少进口食品时，人群缺硒情况更加明显。缺硒地区的人群硒摄入量非常低，例如，尼泊尔硒摄入量为23ug/天，中国营养学会报道中国人均硒摄入量为26ug/天，一些地区甚至低于10ug/天，同时，推荐剂量为55ug/天。硒含量贫乏地区的人群，硒相关疾病的发生率较高，如克山病和癌症。
 
癌症特征为细胞生长不受控制和扩散，并几乎能影响到机体任何组织。肺癌、肠癌和胃癌是全世界男性和女性最常见的癌症，世界卫生组织报道每年大约超过1000万人被诊断为癌症，在癌症高发的情况下，寻找天然产物来抑制癌症的发展成为科学家的重要方向，如硒。
 
天然和合成硒的化学预防剂展示了可预期的活性，1969年，美国的Douglas Frost和Raymond Shamberger研究了硒对于癌症预防的作用，1977年，Gerhard Schrauzer和他的团队证实了硒是一种潜在的癌症抑制剂。在美国和其他地区，众多流行病学研究以及临床前研究均证实了硒的抗癌作用。1973年，Rotruck和他的同事第一次揭开了硒在谷胱甘肽过氧化物酶中的作用，这个酶承担了氧化应激过程中免受损伤的角色。
 
到目前为止，在全球范围内进行的人体临床试验已开展，第一次人类硒干预癌症预防试验在中国进行。8年来，共有20847人服用亚硒酸钠，每天服用30–50ug硒。原发性肝癌发病率明显减少。最近几年，最令人兴奋的消息是克拉克和同事发现在1996个人群中补充富硒啤酒酵母能够降低近50%的整体癌症发病率和死亡率。
 
硒蛋白
硒代半胱氨酸具有半胱氨酸类似的结构，区别在于硒取代了半胱氨酸中的硫原子。含有硒代半胱氨酸的蛋白通常叫做硒蛋白。硒蛋白一般合成途径包括四个细胞基因，分别为selA， selB， selC和selD，该硒蛋白合成机制共分四步，第一步tRNA（selC）与带有电荷的丝氨酸结合，第二步SelA将丝氨酸转化为硒代半胱氨酸，然后，selD提供硒源，selB转录因子识别硒代半胱氨酸信使RNA，最后在核糖体上将其转化为UGA。硒代半胱氨酸根据其在硒蛋白中的位置不同又将硒蛋白分为不同的亚型。
 
谷胱甘肽过氧化物酶
在谷胱甘肽过氧化物酶这类酶中，硒代半胱氨酸位于一个相对短的功能域的N-末端部分。它的主要生理作用是在细胞中控制适当的低水平过氧化氢，从而减少自由基的潜在危害。它提供了对过氧化氢的第二道防线，从而避免过氧化氢对细胞膜和其他细胞结构的损害。至少有六个哺乳动物的GPx已被发现。GPx1酶是哺乳动物细胞浆中的一种抗氧化剂和最主要的抗氧化蛋白，GPx2和GPx3存在于胃肠道中的抗氧化剂等离子体，GPx4也被称为磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶（PHGPx），因为它显著减少羟基脂肪酸，并将其转化为磷脂。GPx5和GPx6仅仅分别在小鼠的附睾和嗅觉上皮细胞中发现。
 
硒蛋白P
硒蛋白P是血浆中主要的硒蛋白，硒蛋白P可以与细胞结合，并在各组织中表达，如血管内皮细胞，肝窦内皮细胞。硒蛋白P在内皮细胞中扮演着硒蛋白转运功能和抗氧化功能。
 
硒蛋白W和R
硒蛋白W是一种低分子量的蛋白质（含87个氨基酸的蛋白质），含有一个硒代半胱氨酸残基；存在四种形式。一个同工型包含谷胱甘肽（GSH）与特定的半胱氨酸残基结合，这提示硒蛋白W可能有氧化还原功能。硒蛋白 R是硒代半胱氨酸结合在C-末端，而这种硒蛋白的功能还未知。
 
硫氧还蛋白还原酶（TrX）
硫氧还蛋白还原酶是一种分布广泛的氧化还原蛋白，这种蛋白具有调节正常细胞和肿瘤细胞的增殖功能，它的特征是硒代半胱氨酸出现在C-端，是核糖核苷酸还原酶的氢供体。它还通过巯基氧化还原调控机制调节酶和转录因子，是DNA合成修复机制必不可少的蛋白之一。
 
甲状腺素脱碘酶
甲状腺主要合成两种激素，T3和T4，T3为甲状腺激素的主要活性成分，主要分布于肝和肾；T4主要是甲状腺产生，并不具有生理活性。在循环和内皮细胞大多数生物活性的T3是由T4脱去一个碘原子形成，而硒依赖的脱碘酶正是这个催化反应的关键酶。通过在T3、T4和其他甲状腺激素代谢物的反应，这三种硒依赖型的甲状腺脱碘酶（I,II,III型）可激活或抑制甲状腺激素，使得硒在甲状腺激素的合成和代谢中成为必不可少的元素之一。
 
硒以两种不同的方式与细胞蛋白相互作用。典型的含硒蛋白化学计量是将硒代半胱氨酸作为蛋白质的一个结构单元，硒作为一种必需的营养素，通常认为与这些硒蛋白有关，如GPx，甲状腺素脱碘酶和TrX。这几种机制均说明硒蛋白的抗癌作用。GPx，硒蛋白P和其他一些硒蛋白可以保护细胞成分免于氧自由基的损伤。
 
HPLC-ICP-MS鉴别硒化合物
硒的化学预防研究已经扩展到更大的人群和硒抑制肿瘤发生的机制方面。虽然用Se元素描述硒是非常方便的，必须指出，硒的化学形式和剂量是其决定营养素、癌症预防剂或其毒性等生物活性的重要因素。硒的化学形式包括与金属形成大的蛋白配合物，例如，在血清、母乳和动物金属硫蛋白以及硒蛋白，食品中的硒化合物和营养补充剂。最近，硒在DNA-顺铂加合物的研究成为热点领域，因为硒化合物降低顺铂治疗的毒性，也防止顺铂治疗的耐药性。硒与碳水化合物结合物也是研究热点，人们在尿液中已经发现一个重要的化合物硒糖。
 
HPLC与ICP-MS联用技术检测被确立为最现实和最有力的形态分析工具。Gray首次在1978年使用DC等离子体从高温中获取离子。今天，ICP-MS是最强大的已知元素探测器。ICP-MS的发展表明，其在生物材料，水和土壤检测硒比用原子吸收光谱法（AAS）或电感—地耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）具有更高得灵敏度。在大量的硒形态研究中，均使用了ICP-MS与HPLC联用技术进行分析。
 
不同原子检测方法系统如原子发射技术或MS与HPLC联用技术对于大量样品，尤其复杂样品的元素分析应用较广，排除了干扰峰对目标峰的影响，这些干扰峰用UV检测时有时峰的水平要高于目标峰的水平，元素选择性原子检测可以减少甚至消除这种干扰。
 
Quijano等人开发建立了用HPLC-ICP-MS技术检测水液中的硒代半胱氨酸，硒代蛋氨酸、亚硒酸盐和硒酸盐，使用了混合柱材料ODS-氨基柱，并用了PH6.0的磷酸盐体系。这种键合的ODS材料可以使氨基酸在死体积外洗脱出来，相对于强离子交换柱具有很好的保留时间；成熟的洗脱顺序与阴离子交换机制树脂的洗脱顺序一致。Koyama等人采用两种不同的色谱柱进行串联，他们成功分离出人类血液中的三个主要含硒蛋白质（白蛋白、GPX、和Se-P）。第一根柱用的是亲肝素柱，第二根柱是凝胶过滤柱，第二根柱流出液直接连接到ICP-MS，串联柱的优点是，快速方便的检测血液中硒分布，并适合分析稳定同位素和示踪金属相互作用研究。利用HPLC-ICP-MS，Koyama等人还发现，在人血浆，硒的吸收与血液中的高分子片段和巯基蛋白是密切相关的。Olivas等人用聚合碱基反相柱，流动相为PH4.5的甲醇水溶液，并含有10-4mol/L戊基磺酸钠，分离出了硒代半胱氨酸，硒代蛋氨酸和三甲基硒离子（见表1结构式）。HPLC-ICP-MS检测限小于1ug/L，但在这些条件下，不能解决硒代半胱氨酸和无机硒分离。
 

 
图1。亚硒酸盐的化学成分（A）、硒酸盐（B），甲硒醇（C）、甲基硒酸（D），三甲基硒离子（E），硒代蛋氨酸（F）、硒代半胱氨酸（G）、硒甲基硒代半胱氨酸（H），硒代甜菜碱（I），和1,4-双-硒氰基亚甲基苯（J）

 
HPLC-ICP-MS技术的局限性在于不提供已知的，未知的，或不可预知化合物的结构信息，因此，它不确定哪些标准是不可用的。这些问题可以通过元素和一部分分子分子量来缓解，可通过ES-MS，ES-MS-MS或MALDI-TOF进行测量。
 
另一种分离技术，通常与ICP-MS联用，是电泳法（凝胶电泳和毛细管电泳）。用凝胶电泳结合ICP-MS、Fan和同事分析了反嘴鹬胚胎蛋白提取物和富硒水的巴斯卵巢中硒的形态，这个实验主要分析硒的毒性机制，从这些样本中，不同区域带的硒蛋白分别被揭示了，这两个样品的其中四条（4100，60，50，和48kda）具有相近的分子量。
 
结合不同的分离技术，ICP-MS成为硒形态的重要工具。一个标志性的发现是在尿液中发现了硒糖。在过去，研究结果表明尿中硒化合物主要是三甲基硒离子（TMSe）离子。然而，应用HPLC-ICP-MS在尿液中已经发现了16种硒形态的化合物，并且其中一些是全新化合物。2002年，使用HPLC-ICP-MS和HPLC-ES-MS技术，Ogra等人和Kobayashi等人报道尿液中存在硒糖（甲基-2-乙酰氨基-2-去氧-1-硒-β-D-吡喃葡萄糖苷和甲基-2-乙酰氨基-2-去氧-1-硒-β-D—半乳糖苷）。2004、bendahl和同事采用毛细管电泳ICP-MS在人体尿液中检测出一个新的硒糖（甲基-2-氨基-2-去氧-1-硒—β-D-吡喃葡萄糖苷）。这些结果表明，硒糖现在已经成为硒代谢物在尿液排泄中的主要成分。
 
硒化合物在癌症预防方面的应用研究
在缺硒人群中，以无机形式补充硒可能不如有机硒。将亚硒酸钠应用于土壤或直接喷洒在叶片上，植物吸收无机硒，通过代谢转化成有机硒来作为硒的补充剂更为安全。
 
目前，研究表明以植物为载体的有机硒具有抗癌活性。植物中大蒜、洋葱和西兰花特别受研究人的关注。Finley等人研究表明喂食含3.0μg/g的高硒西兰花Sprague–Dawley大鼠中的乳腺肿瘤细胞比添加0.1μg的亚硒酸钠或无添加的西兰花喂养的少。第二个实验中，喂食含2.0μg/g的富硒西兰花或者富硒西兰花芽苗的Fisher F-344大鼠中异常结肠隐窝显著的比喂食添加0.1或0.2μg/g的硒酸盐或者无添加的低硒西兰花的少。这些数据表明，高硒西兰花对乳腺癌具有预防作用，并且西兰花芽苗对结肠癌具有预防作用。此外，在2003年，Roberge等人通过液质分析发现西兰花缓冲提取物中硒以甲基硒代半胱氨酸形式存在。
 
分析形态学者Ip等人研究表明硒在大蒜和酵母中主要以谷氨酰基-Se-甲基硒代半胱氨酸（73％）和硒代甲硫氨酸（85％）的形式存在。在大鼠喂养实验中，喂食不同浓度的富硒大蒜相比喂食富硒酵母，总组织硒积累较低。另一方面，富硒大蒜更有效的抑制乳腺癌的癌前病变发展和致癌物诱导。
 
这些发现在硒化合物抗癌活性方面具有重大意义。研究者改变了具有抗癌活性的硒化合物是硒代甲硫氨酸的假设，发现甲基硒代半胱氨酸在化学癌症预防中比硒代甲硫氨酸更有效。在硒含量为1-3mg/kg的甲基硒代半胱氨酸是比硒代甲硫氨酸和亚硒酸盐更好的化学预防剂。
 
一种具有抗癌活性的新硒化合物是甲基硒酸，Dong等人报道甲基硒酸在浓度为5-10μmol/L时以时间依赖性的方式抑制人乳腺癌前病变的生长。相对比下，甲基硒代半胱氨酸在浓度为200μmol/L才能达到相同效果。
 
通过合成方法获得化学预防功效较强和毒副作用减少的硒化合物。目前，合成方法获得具有抗癌活性的有机硒化合物是1,4-双-硒氰基亚甲基苯（p-XYC）。对DMBA诱导的乳腺癌大鼠给予p-XYC，结果显示在p-XYC的浓度为80mg/kg时，可抑制DMBA-DNA加合物的形成。p-XYC的化学预防作用机制可能是抑制DNA加合物的形成。在肺中，p-XYC抑制6-甲氧基鸟嘌呤和7-甲基鸟嘌呤的形成，而5mg/kg的亚硒酸盐对诱导型肺癌没有效果。
 
与化疗剂对比，硒具有化疗剂的毒性的保护治疗。硒被发现具有保护免受毒性的顺铂治疗，以及Cao和同事在2004年发现甲基硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸能提高几种化疗药剂（伊立替康，氟尿嘧啶，奥沙利铂，顺铂，紫杉醇和多柔比星）耐受剂量（MTD）。甲基硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸同样有效地预防伊立替康高两倍或三倍的剂量产生的毒性。
 
硒具有预防耐药性的潜力并提供保护具有毒副作用的抗癌药物治疗，对硒化合物和多类型抗癌药物的综合研究在对抗癌症死亡率的战斗中具有重大的研究意义。这不不仅包括有机和无机硒化合物，而且还包括组合合成有机硒化合物其他化疗剂。
 
甲基硒抗癌活性
大多数癌症化疗预防实验都使用可商购的亚硒酸钠或硒代甲硫氨酸作为测试试剂。 这两种化合物在许多动物模型中均具有抗癌作用。
 
最近报道了硒代甲硫氨酸可以通过将p53从氧化转化为还原型的方式来激活人肺癌细胞中肿瘤抑制蛋白p53的表达预防癌症。然而，大量化学诱导的乳腺肿瘤大鼠模型实验中，Ip和Hayes 发现硒代甲硫氨酸的癌症抑制活性低于亚硒酸盐。喂食硒代甲硫氨酸的大鼠血液和组织，如肝，肾和骨骼肌，硒浓度高于亚硒酸钠组。 因此，在硒代甲硫氨酸治疗大鼠中的硒没有提供更好的预防肿瘤发生。
 
硒代甲硫氨酸可以掺入蛋白质中代替甲硫氨酸，因为它容易酰化甲基信使RNA，另外，它可以通过反式硫化机制转化为硒代半胱氨酸，然后，被β-裂解酶降解为硒化氢（H2Se）。相反，亚硒酸盐被代谢H2Se通过硒代谷胱甘肽和谷胱甘肽硫化硒化合物。H2Se通常被认为是前体用于提供Se用于硒蛋白的合成。H2Se通过硫腺苷甲硫氨酸进一步完成甲基化形成甲基硒醇，二甲基硒和三甲基硒离子。
 
Ip和Ganther，在Se的代谢基础上（Fig.2），提出了甲基化硒化合物是比H2Se化合物更有效的化疗剂。研究化学预防活性的实验表明产生单甲基Se的硒代甜菜碱和Se-甲基硒代半胱氨酸和代谢为H2Se亚硒酸盐Na2SeO3与硒代甲硫氨酸支持这个基本假设。在致癌物诱导的乳腺癌大鼠模型中，硒代甜菜碱和甲基硒代半胱氨酸比其他两种形式硒化合物更有效的起到化学预防作用。
 

 
图2  硒代谢途径

 
如图3所示，硒代甜菜碱首先失去甲基再通过亚甲基碳键形成甲基硒醇。另一方面，甲基硒代半胱氨酸，通过β-裂解酶反应直接转换为甲基硒醇。 此外，不像硒代甲硫氨酸，它不能非特异性地进入蛋白质。
 

 
图3 硒代甜菜碱，Se-甲基硒代半胱氨酸，硒代甜菜碱甲酯和二甲基硒氧化物硒代谢途径示意流程图
 

甲基化的硒化合物毒性小，也正是这个原因，许多甲基硒化合物已经被试验。甲基硒是具有化学癌症预防的关键性的硒代谢产物形式，并且减少毒性相对于其他形式的硒化合物，如亚硒酸盐。总之，甲基化硒化合物如硒代甜菜碱或甲基硒代半胱氨酸用作前体，类似于前药，通过半胱氨酸缀合物β-裂解酶或相关裂解酶的作用获得释放甲基硒醇或甲基硒酸。低浓度的甲基化硒化合物通过体外实验在转化细胞方面表现出具有较强的化学预防效应（细胞凋亡和细胞周期停滞）。 因此，甲基硒代半胱氨酸通过连续提供单甲基化硒以维持临界水平来抑制细胞生长。营养学概念表明高浓度硒化合物代谢过程中产生硒化合物在动物模型系统中起到抗癌作用。
 
Ip等人阐述了亚硒酸盐和甲基硒代半胱氨酸不同的化学预防机制。例如，亚硒酸盐化学预防机制是通过S / G2-M期细胞凋亡来实现，甲基硒代半胱氨酸化学预防机制是通过G1期的细胞凋亡实现。甲基硒代半胱氨酸的好处之一是它不会造成膜损伤。
 
最近关于硒化学预防研究令人兴奋的结果是甲基硒代半胱氨酸显著减少血管的生成。通过乳腺癌中血管密度和血管内皮生长因子为指标来检测到血管生成的减少。通过β-裂解酶催化甲基硒代半胱氨酸形成甲基化硒机制为抗癌活性机制中的关键步骤。另一种硒化合物不需要β-裂解酶转化成甲基硒形式是甲基硒酸。 一旦被细胞吸收，通过非酶和涉及GSH和NADPH的酶反应它容易被还原成甲基化硒形式 。因此，甲基硒酸在细胞中发挥作用不受β-裂合酶因素限制。由此，甲基硒酸作为现成的制剂一旦其进入细胞，就产生单甲基化的硒。 最近Zhao等人研究其化学预防机制发现甲基硒酸通过调节雄激素表达、受体和雄激素受体基因抑制细胞增殖和诱导致癌物来预防前列腺癌。此外，甲基硒酸在大鼠乳腺癌前病变中具有调制细胞周期和细胞凋亡生物标志物的能力。
 
结论
目前，数百种化学品已用于在体内体外模型中来评价抗癌活性。到目前为止，从所有关于人类癌症预防研究表明硒试验是一个最成功的。 虽然硒元素有多方面的影响，但最需要了解的是硒的化学形式和剂量是其生物活性的决定因素。直接分析植物、动物组织和人体液中硒氨基酸和硒蛋白在生物学上仍然是一个巨大的挑战。 更多的实质性工作通过合成硒化合物来制定可用于分析标准。只有这样在研究硒临床的分子化学，生态毒理学和营养学方面的困难得以消除。
 
尿液中含有重要硒化合物硒糖这一事实值得投入更多关注。随着关于硒形态分析方法的发展，预期这些化合物将很快在血清中检测到并有助于了解硒化合物化学预防的机制。
硒的生化转化是实现癌症预防重要的一步。在本文中，审查了不同硒化合物化学预防机制。但还需要深入确定的是多种硒化合物（亚硒酸盐，硒代甲硫氨酸，半甲基硒代半胱氨酸，甲基硒酸和p-XYC）在癌症预防中是协同的或拮抗的作用。
 
原文链接
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0946672X05001033
 

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