摘要：
我们先前研究已经表明，萝卜硫素不仅抑制晚期糖基化产物（AGEs）的形成，而且对AGE暴露的人脐静脉和注射AGE的大鼠主动脉的内皮细胞（HUVEC）发挥抗炎作用。在这里，我们考察了富含萝卜硫素的西兰花芽的水提取物对AGEs形成的影响，然后研究提取物是否可以减弱肿瘤坏死因子-α（TNF-α）或AGE暴露的HUVEC中的炎症或氧化应激反应。将新鲜的西兰花芽在磷酸盐缓冲盐水中打成匀浆，并通过纱布过滤，离心后，获得澄清的提取物。通过酶联免疫吸附测定法测量AGE形成，通过实时逆转录-聚合酶链反应评估基因表达，用荧光染料测量活性氧（ROS）的产生。5％西兰花芽提取物可以抑制AGEs的形成，降低单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），细胞间粘附分子-1（ICAM-1）和AGEs受体（RAGE）的基础基因表达，并上调内皮细胞硝酸 HUVEC中的氧化物合成酶（eNOS）mRNA水平。1％花椰菜芽提取物可以减弱TNF-α，上调HUVEC中的MCP-1，ICAM-1和RAGE mRNA水平。1％西兰花芽提取物的预处理防止了AGEs引起的HUVEC中ROS的产生。 本研究表明富含萝卜硫素的西兰花芽提取物可抑制AGE-RAGE轴并在HUVEC中表现出抗炎作用。补充富含萝卜硫素的西兰花芽提取物可能对血管损伤起到保护作用。
 
1.引言
葡萄糖，甘油醛和甲基乙二醛等糖类可以与脂质，蛋白质和核酸的氨基酸进行非酶促反应，形成称为“晚期糖基化终产物（AGEs）”的衰老大分子，这一过程在炎症和高血糖存在的条件下已显示 [1-9]。越来越多的证据表明，AGEs不仅可以改变大分子的结构完整性和功能，还可以通过与AGEs受体（RAGE）的相互作用引起各种类型细胞和器官的氧化应激的产生和炎症反应，从而促进其发展。许多衰老和糖尿病相关的并发症，包括动脉粥样硬化性心血管疾病，癌症生长和转移，骨质疏松症和阿尔茨海默氏病[1-9]，这些结果表明，AGE-RAGE轴可能是这些破坏性疾病的新型治疗靶点。
我们和其他人的试验结果共同表明，萝卜硫素在体外抑制AGEs的形成，并通过减少RAGE的表达来减少AGE暴露的内皮细胞和AGE输注的大鼠主动脉中的炎症反应[10-12]。此外，口服富含萝卜硫素的西兰花芽提取物已显示出对致癌物质引起的皮肤癌，乳腺癌和胃癌的化学预防活性，并减弱对空气污染物，幽门螺杆菌诱发的胃炎，紫外线辐射诱发的皮肤损伤的过敏反应，以及人体脂肪肝通过其抗炎作用[13-17]。然而，尚不清楚西兰花芽提取物是否会对内皮细胞中的AGE-RAGE轴表现出抑制作用。因此，在本研究中，我们检测了萝卜硫素前体，富含萝卜硫苷的花椰菜芽的水提取物对体外AGE形成的影响，然后研究了该提取物是否能减弱肿瘤坏死因子-α（TNF-α）或AGE暴露的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的炎症反应。
 
2.材料和方法
2.1.材料.牛血清白蛋白（BSA）（基本上不含脂肪酸）和D-甘油醛购自Sigma（St.Louis，MO，USA）。TNF-α购自Cell Signaling Technology（Danvers，MA，USA）。
2.2. AGE-BSA的制备。如前所述制备AGE-BSA [10]。 简言之，将BSA（25mg / ml）在无菌条件下与0.1M甘油醛在0.2M NaPO ₄缓冲液（pH7.4）中，在37℃温育7天。然后通过用磷酸盐缓冲盐水透析除去未掺入的糖。对照非浓缩BSA组在相同条件下孵育，除了如前所述不存在D-甘油醛[10]。
2.3.富含萝卜硫素的西兰花芽提取物的制备。富含萝卜硫素（6μmol的萝卜硫苷/ g）的西兰花芽由ca. Fahey[18]等人鉴定，并在日本广岛的Murakami农场进行培育和存放（Broccoli Super Sprout，Part No.3399642）。富含萝卜硫素的西兰花芽从当地超市获得。将新鲜的西兰花芽（50 g）悬浮并在50 ml磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）中均质化，打浆搅拌并通过纱布过滤，在4℃下以3000 g离心30分钟后，获得所得的透明提取物并在-30℃下储存。稀释的西兰花芽提取物用磷酸盐缓冲盐水或细胞培养基制成终浓度为1％和5％的西兰花芽提取物。
2.4.AGEs的测量。在存在或不存在指定浓度的西兰花芽提取物的情况下，将BSA（25mg / ml）与1mM甘油醛一起温育1天，然后如前所述用酶联免疫吸附测定法测量AGE水平[19]。测定内和测定间变异系数分别为6％和2.6％。
2.5.细胞。按照厂家建议，从Lonza Group Ltd.（瑞士巴塞尔）获得的HUVEC在补充有2％胎牛血清，0.4％牛脑提取物，10ng / ml人表皮生长因子和1μg/ ml氢化可的松的内皮基础培养基中培养。TNF-α，AGEs和/或西兰花芽提取物的处理在缺乏表皮生长因子和氢化可的松的培养基中进行。
2.6.实时逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。在存在或不存在指定浓度的西兰花芽提取物的情况下，用或不用10ng / mlTNF-α处理HUVEC 4小时。然后根据厂家的说明用RNA水溶性4 PCR试剂盒（AmbionInc.，Austin，TX，USA）提取总RNA。根据厂家推荐，使用按需测定和TaqMan 5荧光核酸酶化学（Applied Biosystems，Foster city，CA，USA）法进行实时定量RT-PCR。引物的标志是人单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），细胞间粘附分子-1（ICAM-1），RAGE，内皮型一氧化氮合酶（eNOS），β-肌动蛋白和18S rRNA基因的引物ID为Hs00234140 m1，Hs00164932 m1，Hs00542592 g1，Hs01574659 m1，Hs99999903 m1和Hs99999901 s1。
2.7.活性氧（ROS）产生的测量。如前所述[10]，使用荧光探针羧基-H₂ DFFDA（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）测量ROS产生。简言之，将HUVEC用或不用1％西兰花芽提取物处理4小时。用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞后，在1μM羧基H₂ DFFDA存在下，将细胞与100μg/ ml AGEs或100μg/ ml非糖基化BSA一起温育25分钟，然后测量荧光强度。
2.8.统计分析。所有值均表示为平均值±标准偏差。单因素方差分析，然后是图2（b），2（c）和4（a）的Tukey HSD测试，图1和2（a）的Games-Howell测试，图4（c）的Steel-Dwass测试和图3和4（b）的学生t检验用于统计比较; p <0.05被认为是显着的。
 
3.结果
我们首先研究了西兰花芽提取物对AGEs形成的影响。 如图1所示，用1mM甘油醛孵育BSA 1天，增加了AGEs的形成，其被5％但不是1％的花椰菜芽提取物显著抑制。
5％西兰花芽提取物的4小时孵育显着降低HUVEC中的基础MCP-1和ICAM-1 mRNA水平，同时其上调eNOS mRNA水平（图2）。 然而，除了ICAM-1，1％的西兰花芽提取物不影响这些基因表达，通过用1％西兰花芽提取物处理，基础ICAM-1 mRNA水平降低至对照细胞的40％（图2（b））。
我们接下来研究了1％西兰花芽提取物对TNF-α暴露的HUVEC中MCP-1，ICAM-1和eNOS基因表达的影响。如图3（a）和3（b）所示，1％西兰花芽提取物显著抑制TNF-α上调MCP-1和ICAM-1的mRNA水平。TNF-α降低HUVECs中eNOS基因的表达，但不受1％西兰花芽提取物的影响（图3（c））
我们进一步研究了西兰花芽提取物对HUVEC中RAGE基因表达的影响。如图4（a）所示，西兰花芽提取物剂量依赖性地降低HUVEC中的基础RAGE mRNA水平。 此外，1％西兰花芽提取物显着抑制TNF-α诱导的HUVEC中RAGE mRNA水平的上调（图4（b））。尽管AGEs在载体预处理的HUVEC中引起ROS产生，但在1％西兰花芽提取物预处理的HUVEC中未观察到AGE的ROS诱导作用（图4（c））。
 
循证补充和替代医学

图1：西兰花芽提取物对体外AGEs形成的影响。在存在或不存在指定浓度的富含萝卜硫苷的西兰花芽提取物的情况下，将BSA与1mM甘油醛一起温育1天，然后用酶联免疫吸附测定法测量AGEs的水平。每组N = 3。 **，与载体对照值相比p <0.01。
 
4.讨论
在这项研究中，我们首次发现富含5％不是1％萝卜硫素在体外对布鲁氏菌显着抑制AGEs的形成。当西兰花芽在沸水中提取并且提取物用活性白萝卜素酶处理时，大约一半的萝卜硫苷（西兰花芽中的萝卜硫素的前体）已被证明可转化为萝卜硫素[20]。因此，如果我们假设冷水的提取效率约为沸水的1 / 3~2 / 3，那么新鲜西兰花芽中的萝卜硫苷会被内源性黑芥子酶水解并转化为萝卜硫素，效率约为50％[18]。用于本实验的1％和5％花椰菜芽提取物估计含有大约1％，分别为2.5?5和12.5?25μM的萝卜硫素。基于我们之前的发现，25μM但不是0.4μM的萝卜硫素在体外抑制AGEs的形成[12]，5％花椰菜芽提取物对AGE形成的抑制作用可能主要归因于其高含量的萝卜硫素。每天摄入25克富含萝卜硫苷的西兰花芽2个月，可显着降低健康志愿者血清AGEs水平20％，同时伴随着AGEs与可溶性RAGE的比例下降，RAGE是AGE-RAGE活化的标志物 [12,21]。 总之，这些观察结果表明，食用富含萝卜硫素的西兰花芽提取物可以减少人体内AG-RAGE系统的活化。
我们在这里发现5％西兰花芽提取物4小时使HUVEC中MCP-1，ICAM-1和RAGE的基础基因表达水平降低50-90％，同时它将eNOS mRNA水平增加至对照值的1.5倍。因此，这种浓度的西兰花芽提取物不太可能对HUVEC产生毒性作用。 然而，由于5％西兰花芽提取物对未经处理的HUVECs的影响很大，我们在TNF-α或AGE暴露的HUVEC实验中选择了1％西兰花芽提取物的浓度。在本研究中，我们还发现TNF-α诱导MCP-1，ICAM-1和RAGE mRNA水平的上调，并且被1％的西兰花芽提取物显着减弱。1％西兰花芽提取物中MCP-1，ICAM-1和RAGE mRNA水平的降低程度在未处理和暴露于TNF-α的HUVEC中几乎相似。已显示2.5μM的萝卜硫素可刺激NF-E2相关因子-2（Nrf2）的核转位并诱导II相抗氧化酶，从而抑制氧化还原敏感的转录因子核因子-κB（NF）-κB）激活[22]。鉴于MCP-1，ICAM-1和RAGE基因表达受NF-κB转录调控[10,23]，1％西兰花芽提取物可以减少基础和TNF-α诱导的MCP-1，ICAM-1和通过抑制NF-κB活化，HUVEC中的RAGE mRNA水平可能依赖于萝卜硫素诱导的Nrf2激活。为了支持我们的推测，据报道含有1％西兰花芽提取物（5μM萝卜硫素），可抑制HUVEC中氧化低密度脂蛋白诱导的氧化应激的产生和炎症反应，在敲除Nrf2的模型中其有益作用被减弱 [24]。此外，我们先前已经证明1.6μM萝卜硫素还抑制AGE暴露的HUVEC中的氧化应激产生和炎症反应[10]。这些发现表明，与AGE形成的情况一样，西兰花芽提取物在HUVEC中的抗炎作用可能主要归因于萝卜硫素。然而，我们不能完全排除西兰花芽提取物中含有的其他植物化学物质可能发挥抗炎作用的可能性。事实上，据报道β-胡萝卜素与槲皮素或维生素C和E联合可以恢复抗氧化酶活性并抑制苯并[a] 芘暴露的蒙古沙鼠肺部的NF-κB活化[25]。此外，槲皮素和萝卜硫素在AGE暴露的HUVECs中可以抑制ROS的产生和MCP-1和RAGE基因的表达[12]。虽然槲皮素是西兰花芽中含有的主要黄酮类化合物之一（50μg槲皮素/ g西兰花芽）[26]，但在我们目前的研究中，认为槲皮素不太可能起到抗炎作用，因为它几乎不溶于水[26]，27]。
我们和其他人研究结果同时表明，RAGE与AGEs的结合会引起HUVECs中氧化应激的产生和炎症反应[28-30]。在这项研究中，1％西兰花芽提取物不仅降低了未处理和TNF-α处理的HUVEC中的RAGE mRNA水平，而且还阻断了AGEs引起的ROS产生。因此，西兰花芽提取物可以通过至少两种机制减弱AGE-RAGE途径的活化：一种是抑制AGE形成，另一种是抑制RAGE表达。由于AGE-RAGE相互作用介导的ROS产生可以进一步刺激AGEs的形成和诱导RAGE [31-33]，因此西兰花芽提取物可以打破AGE-RAGE轴和ROS产生之间的恶性循环。
越来越多的证据表明，MCP-1和ICAM-1刺激炎症细胞向内皮细胞的募集和牢固粘附，从而促进动脉粥样硬化的发展和进展[34-36]。此外，内皮细胞衍生的一氧化氮不仅可以预防内皮功能障碍，还可以抑制炎症和血栓形成反应，从而在维持血管血管稳定中发挥关键作用[37,38]。此外，受损的内皮功能与慢性肾病大鼠动脉组织中Nrf2活性降低有关[39]，而Nrf2的激活已被证明可增加内皮细胞中eNOS的表达和磷酸化[40]。这些观察表明，西兰花芽提取物可通过其抗炎特性部分地通过激活Nrf2-NO系统而对血管损伤起到保护作用。
 
循证补充和替代医学

图2：西兰花芽提取物对HUVEC中MCP-1（a），ICAM-1（b）和eNOS mRNA水平（c）的影响。用或不用指定浓度的富含萝卜硫苷的花椰菜芽提取物处理HUVEC 4小时。然后通过实时PCR转录和扩增总RNA。数据通过β-肌动蛋白-RNA-（a和b）或18S rRNA-衍生信号（c）的强度归一化，然后与载体的对照值相关。 每组N = 3。 **，与载体对照值相比p <0.01。

图3：西兰花芽提取物对暴露于TNF-α的HUVEC中的MCP-1（a），ICAM-1（b），和eNOSmRNA水平（c）的影响。在存在或不存在1％富含萝卜硫苷的西兰花芽提取物的情况下，用或不用10ng / ml TNF-α处理HUVEC 4小时。然后通过实时PCR转录和扩增总RNA。 数据通过18S rRNA衍生信号的强度归一化，然后与载体的值相关.N = 3个组。与TNF-α单独的值相比，##，p <0.01。**，与载体的对照值相比，p <0.01。

图4：西兰花芽提取物对HUVEC中RAGE mRNA水平（a和b）和ROS产生（c）的影响。（a和b）在存在或不存在1％的情况下，用或不用10ng / ml TNF-α处理HUVECs 富含萝卜硫素的西兰花芽提取物4小时。然后通过实时PCR转录和扩增总RNA。通过β-肌动蛋白mRNA-（a）或18S rRNA衍生的信号（b）的强度对数据进行归一化，然后将其与载体的值相关联。（c）用或不用1％西兰花芽提取物处理HUVEC 4小时。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞后，在羧基-H₂ DFFDA存在下，将细胞与100μg/ ml AGEs或100μg/ ml非糖基化BSA一起温育25分钟，然后测量荧光强度。 *和**，分别与载体对照值相比，p <0.05d p <0.01。 ＃，与TNF-α单独的值相比p <0.05。 N.S：不显著。
 
5.结论
     在这项研究中，我们无法澄清西兰花芽提取物中可能与观察到的效果有关的活性成分。然而，本研究的目的是澄清富含萝卜硫素的西兰花芽的水提取物是否能够抑制AGE-RAGE轴并且在HUVEC中表现出抗炎作用，如在萝卜硫素的情况下[10,12]。我们目前的研究表明富含萝卜硫素的西兰花芽提取物可通过几种机制发挥抗血管损伤的有益作用，例如抑制AGE形成，抑制炎症反应，降低RAGE表达和上调eNOS mRNA水平。需要进一步的纵向临床研究来阐明富含萝卜硫素的西兰花芽提取物的补充是否可以预防动脉粥样硬化性心血管疾病的发展和进展。
 

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